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RT-PCR实验“两步法”与“一步法”

RT-PCR 的实验操作分为“一步法”与“两步法”两种。

一步法 RT-PCR 能克隆微量 mRNA 而不需构建 cDNA 文库（即 cDNA 合成与 PCR 反应在同一 Buffer 及酶中进行，一步法完成），省略了 cDNA 与 PCR 之间的过程。两步法 RT-PCR 首先用反转录酶合成 cDNA，然后以 cDNA 为模板进行 PCR，即 RNA 反转录与 PCR 扩增分两步进行。

一步法 RT-PCR 与两步法相比快速、简便、减少了污染机会、减少了 RNA 二级结构、减少了 PCR 反应的错配率。RT-PCR 两步法的优势在于存在中间产物 cDNA，便于保存；且第二步 PCR 只取逆转录反应产物的 1/10 进行反应，有利于 PCR 条件的调整，实验重现性强。

两步法可以在第二步 PCR 反应体系中加入特异性引物，其灵敏度比一步法高。

两步法的实验预算要低于一步法。但是由于两步法包括第一链 cDNA 合成和随后的 PCR 反应，容易产生污染问题。