EASYspin 全血 RNA 快速提取试剂盒 (DNase I )

EASYspin 全血 RNA 快速提取试剂盒 (DNase I )

商品属性：

产品名称	规格	货号
EASYspin 全血 RNA 快速提取试剂盒 (DNase I )	50 次	BJ-PJ6325

商品介绍：
保存条件：本试剂盒在规定保存温度储存 12 个月不影响使用效果。
产品介绍：
红细胞裂解液选择性裂解红细胞,然后独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解白细胞 和灭活细胞 RNA 酶，然后用乙醇调节结合条件后，RNA 在高离序盐状态下选择性吸 附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液 将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的 RNase free H2O 将 RNA 从硅基质膜上洗 脱。
自备试剂：乙醇，β-巯基乙醇
注意事项：
1.第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
2.需要自备一次性注射器。
3.裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4.关于DNA的微量残留：
由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的 DNA 残留（一般电泳 EB 染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大，如果要进行严格的 mRNA 表达量分析如荧光定量 PCR，我们建议在进
行模板和引物的选择时：
⑴选用跨内含子的引物，这样 DNA 就不能作为模板参与扩增反应。
⑵选择基因组 DNA 和 cDNA 上扩增的产物大小不一样的引物对。
5.RNA 纯度及浓度检测：
完整性：RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度 1.2%；0.5×TBE 电泳缓冲液；150V，15 min)检测完整性。由于细胞中 70%-80%的 RNA 为 rRNA，电泳后 UV下应能看到非常明显的 rRNA 条带。动物 rRNA 大小分别约为 5 kb 和 2 kb，分别相当于 28S 和 18S rRNA。动物 RNA 样品中最大 rRNA 亮度应为次大 rRNA 亮度的 1.5-2.0倍，否则表示 RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的 RNA，OD260/OD280 读数（10 mMTris, pH7.5）在 1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的 pH 值影响。同一个 RNA 样品，假定在 10 mM Tris，pH7.5 溶液中测出的 OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在 1.5-1.9 之间，但这并不表示 RNA 不纯。
浓度：取一定量的 RNA 提取物，用 RNase-free 水稀释 n 倍，用 RNase-free 水将分光光度计调零，取稀释液进行 OD260，OD280测定，按照以下公式进行 RNA 浓度的计算：
终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数 n)×40
操作步骤：
 使用前将 10×RLB（RNase-free）用 DEPC 处理水稀释到 1×。
 操作前在裂解液 RLT 中加入β-巯基乙醇至终浓度 1%，如 1 ml RLT 中加入 10 μl β- 巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的 RLT 4℃可放置一个月。
1.在适合大小的RNase free离心管中加入1体积（<1.5 ml）加入各种抗凝剂新鲜血液 (颠倒混匀后)和 3 体积的 1×RLB（RNase free），颠倒混匀，可轻弹管壁,确保混匀。
2.室温放置 10 min（期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞）。如果 RNA 降解严重,可在冰上裂解,但是时间可长一些以充分裂解。
3.12,000 rpm 离心 20 sec，倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团。如发现红细胞大量残留可重复 2，3 步骤。
4.涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀完全松散重悬，加 350 μl（<0.5 ml 全血或<2×10 6白 细胞）或者 600 μl（0.5-1.5 ml 全血或 2×10 6-1×10 7 白细胞）裂解液 RLT，吹打混匀 后用手剧烈振荡 20 sec，充分裂解。
5.用带钝针头的一次性 1 ml(配 0.9 mm 针头) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到满 意匀浆结果(或者电动匀浆 30 sec)，可以剪切 DNA，降低粘稠度和提高产量。
6.较精确估计裂解物体积，加入等体积的 70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!）， 此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
7.将混合物(每次小于 700 μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱 RA 中（吸附柱放入 收集管中），12,000 rpm 离心 30-60 sec，弃掉废液。
8.加 350 μl 去蛋白液 RW1，室温放置 30 sec，12,000 rpm 离心 30 sec，弃掉废液。将吸 附柱 RA 放回收集管中。
9.DNase I 工作液的配制：取 10 μl DNase I 储存液放入新的 RNase-free 离心管中，加入 70 μl RDD 溶液，轻柔混匀。
10.向吸附柱 RA 中央加入 80 μl DNase I 工作液，室温放置 15 min（一般情况下室温放 置可得到较好的消化效果，如果室温效果不佳可选择在 37℃放置 15 min）。
11.加 350 μl 去蛋白液 RW1，室温放置 30 sec，12,000 rpm 离心 30 sec，弃掉废液。将 吸附柱 RA 放回收集管中。
12.加入 500 μl 漂洗液 RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心 30 sec， 弃掉废液。加入 500 μl 漂洗液 RW，重复一遍。
13.将吸附柱 RA 放回空收集管中，12,000 rpm 离心 2 min，将吸附柱置于室温放置数分 钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。