网站信息

PCR反应循环参数说明

多聚酶链式反应即PCR（polymerase chain reaction）技术，应用这一技术可以将微量目的基因（DNA片段）扩增一百万倍以上。PCR反应理论的提出和技术的完善对于分子生物学的发展具有特殊的意义，它以敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等优点迅速成为分子生物学研究中应用最为广泛的方法之一，并使得很多以往无法解决的分子生物学研究难题得以解决。PCR反应循环参数：

1.预变性
模板DNA*变性与PCR酶的*激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。
2.变性步骤
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列*变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不*，易造成扩增失败。
3.引物退火
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。
4.引物延伸
引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
5.循环数
大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。
6.最后延伸
在最后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸*，并使单链产物退火成双链。