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实验步骤：
1. 制备冻存液，冻存液比例：本实验室采用70%基础培养基+20%FBS+10%DMSO，不同实验室及不同细胞可能略有差异，也可采用55%基础培养基+40%FBS+5%DMSO；

2. 取形态良好，处于对数生长期的细胞，对其消化、离心 (1500rpm离心8min)、计数；

3. 根据细胞数量加入对应的冻存液，使细胞密度维持在300-500w/mL；

4. 小心用镊子打开冻存管管盖，每管分装1-1.5mL含细胞的冻存液，拧紧盖管，做好标记。

5. 分装好的冻存管转入程序降温盒后直接放-80℃过夜；

6. 若没有程序降温盒，则按下列顺序依次降温：室温→4℃20min→-20℃30min→-80℃过夜，注意转移过程中要保冷，避免产生温差或冻存管融化；

7. 从-80℃冰箱取出冻存管迅速转移到液氮长期保存。

注意事项：

1. 为保持细胞最大存活率，一般都采用慢冻存融的方法。

2. 冻存物距液氮面越近温度越低。标准的低冻速度为－1℃~12℃/分钟，当温度下降达－25℃时，下降速度可增至－5~－10℃/分钟，到－100℃时则可迅速冻入液氮中。因此要适当掌握冻存物下降入液氮中的速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促冰晶形成。

3. 初次冻存者在下降冻存时，宜先用细木棒伸入罐中探测液面位置，然后需用温度计与冻存物并行的办法，以观测下降冻存物的速度、冻存物与液氮液面距离和温度三者关系，当已掌握以上各参数和冻存技术熟练后，仅按下降时间和下降距离便可获理想冻存效果。

4. 各种细胞对冻存速度的要求也不一样；上皮细胞和成纤维细胞耐受性可能大些，骨髓干细胞－2~－3℃/分钟合适；胚胎细胞耐受性较小，不宜太快。总之在一开始时，下降速度不能超过－10℃/分钟。

5. 用什么防护剂合适和用量多大，要依细胞而定，初代培养细胞用DMSO 较好，一般细胞可用甘油；用量以较小为好。有人认为人皮肤上皮细胞贮存在20%-30%甘油中很好。

6. 原则上细胞在液氮中可贮存多年，但为妥善起见，冻存一年后，应再复苏培养一次，然后再继续冻存。

7. 将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤

8. 注意自身的安全，对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂例如DMSO，并避免尖锐物品伤人等。