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PCR检测试剂盒引物设计的基本原则

PCR检测试剂盒引物设计的基本原则：

1、引物长度：

一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。

2、引物的特异性：

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

3、序列Tm值：

引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度。退火温度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5～8)

4、G+C含量：

有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5、引物的3′端：

引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰；引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高； 引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败

6、引物的5′端：

引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。